Материал Здоровью 24 предоставил Куншт – это украинское научно-популярное медиа, которое сочетает науку и искусство.
Также по теме: ГМО-дети из Китая, кроме иммунитета к СПИДу, могли получить еще и суперспособности
Молодые супруги сидели в кабинете врача и с волнением ждали результатов генетического анализа. "Ну вот – ваши результаты", – улыбаясь, сказал врач. "Во-первых, поздравляю, – у вас будет мальчик! А во-вторых, как мы с вами и предполагали, у него есть мутация гена дистрофина, расположенного на хромосоме Х.
Такая мутация приводит к развитию миодистрофии Дюшена. Миодистрофия Дюшена – генетическая патология, которая проявляется в двигательной пассивности, приводит к атрофии мышц и не лечится медикаментозно. Поэтому я направляю вас на курс генетического редактирования. И не беспокойтесь: процедура не сложная и не болезненная, а эффективность редактирования очень высока – 90% успеха".
Генетическое изменение может улучшить жизнь / unsplash.com
Зря вы думаете, что это был фрагмент фантастического рассказа о далеком будущем. Такая ситуация может стать реальностью уже завтра. Развитие науки в результате стремления человечества улучшить себя и окружающий мир стремительно приближает к нам похожие диалоги.
Подобно тому, как когда-то воплотились в реальность полеты в космос и глубоководные погружения, описанные еще Жюлем Верном, станет возможным и лечение целого ряда наследственных, онкологических и хромосомных генетических заболеваний, которые сегодня трагедия для родителей и самих больных.
Будущее началось уже в 2013 году. Именно тогда генные инженеры продемонстрировали эффективное действие системы CRISPR/Cas. Открытие CRISPR произвело научный бум – целая лавина исследований с этой системой показали эффективное действие в клетках всех живых организмов. Появились мыши, обезьяны и свиньи с мутациями, специально вызванными с помощью именно CRISPR/Cas. А саму систему щедро наградили метафорическими названиями: молекулярная машина, умные ножницы, молекулярные ножницы и др.
Что такое CRISPR/Cas? И где ее нашли?
Хотя формально наша история начинается с 2013 года, впервые CRISPR была описана еще в 1987 году. Ее случайно обнаружили в геноме классического модельного объекта в микробиологии – кишечной палочки. Японские ученые заметили, что гены бактерии содержат определенные палиндромные последовательности. Палиндром – буквенная последовательность, которая одинаково читается в обоих направлениях (слева направо и справа налево), которые повторяются и разделены спейсерами (уникальными пустыми участками). Что это такое и какова функция найденных структур – тогда не поняли.
Ученые даже не подозревали, что их случайное открытие повлечет настоящую революцию в молекулярной генетике и генетической инженерии. Позже такие структуры нашли и у многих других прокариотов. Прокариоты – организмы, клетки которых не содержат ядра. Большинство прокариотов является бактериями: 45% всех известных ныне бактерий и 85% архей. Археи – одна из групп живых организмов, в которую входят микроскопические одноклеточные прокариоты, которые очень отличаются рядом физиолого-биохимических признаков от настоящих бактерий.
А вот в геномах эукариотов (организмы, характеризующиеся преимущественно полигеномнимы клетками и морфологически сложившимся ядром) и вирусов систему не нашли. А уже в 2002 году появилось теперь известное название – CRISPR (англ. Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats – короткие палиндромный повторы, регулярно расположенные группами).
В 2005-м три исследователя (Франциско Мохика, Кристин Пурсель, Жиль Вернье) независимо друг от друга обнаружили сходство спейсерных последовательностей в нехромосомных элементах, таких как вирусы и плазмиды. Более того, спейсеры CRISPR-кассет у бактерий-стрептококков Streptococcus thermophilus и S. VestibularisStreptococcus thermophilus, или Стрептококк термофильный – вид грамположительных молочнокислых бактерий. S. Vestibularis также относится к семейству Стрептококков часто совпадают с участками генов бактериофагов (вирусов, поражающих бактерии), которые не являются характерными именно для этих бактерий.
И во время глубокого анализа создавалось впечатление, что спейсеры – это нечто вроде обломков чужеродных генов, которые "заселили" бактерии. Кроме этого, ученые заметили, что устойчивость к фаговым (вирусным) инфекциям, например, у Streptococcus thermophilus зависит от количества спейсеров в CRISPR-структурах. Чем больше различных спейсеров – тем выше устойчивость бактерий к различным видам фагов. Интенсивное изучение спейсеров и CRISPR-структур помогло выяснить их функцию в клетке – защита прокариотов от вирусов и плазмид.
То есть для бактерий это своеобразная иммунная система, а спейсеры – обломки вирусных генов, образующих наследственную иммунную память. Результаты исследований были опубликованы в журнале Science в 2007 году, что стало первым экспериментальным подтверждением защитного действия системы CRISPR/Cas и важной роли в ней именно спейсерних последовательностей.
Так как обломки вирусных генов помогают бактериям преодолеть вирусные инфекции?
Выяснилось, что из "остатков" вирусной ДНК в клетке синтезируются малые РНК. Их назвали CRISPR РНК, или crРНК, и именно они распознают вирусную ДНК. Однако этого недостаточно для нейтрализации фага, поэтому в игру вступают другие компоненты – Cas-белки. Cas-белки – белки, соединенные с CRISPR-структурами. Cas-белки и crРНК работают в команде: crРНК распознает чужую фаговую ДНК, а Cas-белки и являются теми "молекулярными ножницами", или "генным скальпелем", нейтрализующим чужеродную ДНК.
Ученые совершили прорыв в генетике / unsplash.com
Среди Cas есть белки с эндонуклеазной активностью (эндонуклеазы – белки из группы нуклеаз, расщепляющие фосфодиэстерные связи внутри полинуклеотидной цепочки, то есть расщепляют ДНК в определенных местах). Эндонуклеазная активность – способность белка разрезать ДНК, то есть они могут "разрезать" распознанную ДНК на куски, и дальше клетка легко утилизирует остатки. А главное – после такой фрагментации фаговая ДНК не сможет захватить бактериальную клетку и паразитировать в ней.
Кажется, не может существовать никакой связи между иммунитетом бактерий и редактированием генетических ошибок у людей. Но это только на первый взгляд. Довольно быстро ученые научились использовать "генный скальпель" в своих интересах. В 2012 году группа ученых из университета Беркли (Эмануэль Шарпантье и Дженнифер Дудна) опубликовали статью с предложением перепрограммировать систему CRISPR/Cas так, чтобы иметь возможность контролировать ее работу и определять места разреза ДНК.
Они доказали, что можно получить любую искусственную crРНК (другое название – гид или проводник), которая будет узнавать ДНК там, где нужно нам. Существует несколько разновидностей системы CRISPR/Cas. Один из них кодирует не весь комплекс белков Cas, а только один – Сas9. Эта универсальная молекула выполняет сразу несколько функций: она связывает чужую ДНК и разрезает ее. Именно в системе с белком Сas9 ученые нашли точный инструмент для редактирования генома.
Ученые Джордж Черч и Фен Чжан из Института Броуда MIT (Массачусетского технологического института – прим. ред.) параллельно с группой Шарпантье-Дудны показали, что Сas9 и РНК-гид могут функционировать и в клетках высших многоклеточных организмов, в частности человека.
Мутации в определенных местах генома могут приводить к изменению функции гена, к появлению новых признаков и даже к его отключению. Система CRISPR/Cas9 намного эффективнее и дешевле по сравнению с уже известными технологиями создания ГМО и нокаутных организмов.
Ремонт генов
Но для генома человека этого будет мало. Чтобы исправить ошибку в гене, мы должны не только уничтожить деформированный участок гена или хромосомы, но и заменить его на правильную последовательность. Поэтому здесь нам помогут уже достаточно известные элементы клетки – специальные ферменты репарации. Репарация ДНК – набор процессов, с помощью которых клетка находит и исправляет повреждения молекул ДНК, которые кодируют ее геном, способны "видеть" разрывы молекулы ДНК и "сшивать" ее.
Вот как это происходит: на помощь ферментам репарации приходит двойной набор хромосом (поврежденная и целая), содержащийся в каждой клетке. "Правильная" (целая) версия – это своеобразная матрица, которая помогает понять, как "залатать" дыру в разорванной копии. Кроме того, в клетку вместе с искусственной РНК-гид и Cas9 можно ввести и нужную нам копию гена. Таким образом, мы можем точно, как скальпелем, удалить мутацию с гена, уничтожив причину той или иной болезни.
Новооткрытая система привела генетиков к результатам, которые делают ремонт сразу нескольких мутировавших генов. Так, осенью 2015 года произошло невозможное – генетик Джордж Черч объявил о модификации (отключении) в эмбрионе свиньи аж 62-х генов.
Читайте также: Новую генную технологию CRISPR впервые использовали для лечения врожденной слепоты
А это в десять раз больше, чем удавалось модифицировать до открытия системы CRISPR/Cas9! Все 62 гена были "заселены" вирусом, который обычно является существенным препятствием для выращивания человеческих органов в мини-свинках с целью их дальнейшей трансплантации. Модифицировав эти гены, ученый смог преодолеть и вирус.
Не ножницами едиными
Однако CRISPR/Cas9 действует не только как ножницы или скальпель. Впоследствии ученые придумали причудливую штуку под названием "сломанные ножницы" – белок dCas9, что вообще потерял способность разрезать ДНК. Новый белок, как и его дикотипный родственик. Дикотипный – "дикий тип" в биологии – это норма вида; то, что является естественной нормой без спонтанных или вызванных искусственно мутаций, способен образовывать комплексы с РНК-гида и ДНК в запрограммированных местах.
Редактирование генома может вылечить многие болезни / unsplash.com
Эта особенность быстро получила оригинальное применение: появился молекулярный фонарик! Прикрепив к белку dCas9 зеленый флюоресцентный белок (англ. GFP – Green Fluorescent Protein), ученые обозначают конкретный участок хромосомы живой клетки и наблюдают за ней под микроскопом.
А это позволяет более точно понимать генетическую основу возникновения болезней или, например, развития эмбриона, чтобы воздействовать на них в будущем.
Уже сегодня
Сейчас существует три компании, серьезно занимающиеся разработкой медицинского применения CRISPR/Cas9: американские Editas Medicine и Intellia Therapeutics и международная CRISPR Therapeutics. Все три на стадии стартапов, но даже теперь их бюджеты впечатляют: $43 млн, $15 млн, $89 млн соответственно. Их инвесторы – крупные биофармацевтических компании, готовые вкладывать огромные суммы. Например, только CRISPR Therapeutics в апреле 2016 года получила $64 млн.
Благодаря случаю с кишечной палочкой мы теперь не только знаем, как бактерии защищаются от вирусных атак, но и обладаем инструментом для ремонта генов: создаем их новые варианты, обозначаем их, включаем и выключаем.
Такая истинно демиургийная власть вдохновила ученых начать воплощать замысел о коррекции генома человека. 14 апреля 2015 года группа китайских ученых под руководством Цзюньцзе Хуана из Университета Сунь Ятсена (в городе Гуанчжоу) опубликовали в Protein & Cell исследование "CRISPR/Cas9-mediated gene editing in human tripronuclear zygotes" (с англ. "Редактирование генов с помощью CRISPR/Cas9 в триплоидных зиготах человека").
Это стало первой попыткой отремонтировать генную мутацию в эмбрионе человека. Этой публикации предшествовала достаточно напряженная и бурная дискуссия в научных кругах, а известные и уважаемые журналы Science и Nature отказались публиковать ее на своих страницах по этическим причинам. Ведь сейчас в большинстве стран наложен мораторий на использование человеческих эмбрионов с целью генетических экспериментов.
Что же вызвало такую реакцию научного сообщества? Генетики попытались вылечить генетическую патологию бета-талассемию. Бета-талассемия – наследственная болезнь крови, вызванная мутацией в одном из генов гемоглобина на уровне эмбриона. Для эксперимента взяли 86 оплодотворенных яйцеклеток, содержащих мутацию гена гемоглобина в материнских хромосомах.
Результат не оправдал ожиданий ученых: из 86 эмбрионов только в четырех мутировавший ген удалось изменить. В других система или не нашла и не распознала нужный фрагмент, или клетки не "зашили" дыру на месте мутации. Кроме того, CRISPR/Cas9 сделала и много ложных разрезов ДНК, то есть не там, где была мутация. С одной стороны, эффективность очень низкая как для "этически специфического" объекта эксперимента, а с другой – четыре эмбриона все же были успешно отредактированы!
В 2016 году произошло еще одно важное событие в научной области. Британское государственное агентство HFEA (англ. Human Fertilization and Embryology Authority – Ведомство по эмбриологии и оплодотворению человека – пер. ред.) позволило проводить генетическую модификацию человеческих эмбрионов с помощью CRISPR/Cas9. К тому времени подобные исследования были запрещены как в Великобритании, так и в остальных странах Западной Европы и США.
Но разрешение касается только конкретной исследовательской группы Кэти Никен из Института Фрэнсиса Крика. Все их действия будут тщательно контролировать, а эмбрионы будут уничтожены через 14 дней. Поэтому Туманный Альбион стал первой из западных стран, где официально разрешено применение технологии редактирования генома человека и человеческого эмбриона. Оставляя в стороне религиозно-этический аспект вопроса, фанаты науки могут только порадоваться, ведь их ждут новые сенсационные открытия в области генетического программирования.
Текст подготовила Оксана Пивень – кандидат биологических наук, сотрудник Института молекулярной биологии и генетики НАН Украины.
Хотите стать умнее за 5 минут? Подписывайтесь на рассылку Куншт о новостях науки и технологий.